抗性淀粉檢測試劑盒(微量法100T/96S）
| 貨號 | SH0635 | 售價（元） | 3000 |
| 規格 | 100T/96S | CAS號 |
- 產品簡介
- 相關產品
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貨號 |
名稱 |
規格 |
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SH0635 |
抗性淀粉檢測試劑盒(微量法100T/96S） |
100T/96S |
抗性淀粉（RS）是指在人小腸內不能被酶解的淀粉，在大腸部分或完全發酵。RS是總膳食纖維的組分之一。
抗性淀粉的測定方法： 樣品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振蕩水浴孵育16小時，在這期間，通過兩種酶的聯合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育結束后，加入等體積的乙醇或工業甲基化酒精（IMS,變性乙醇）終止反應。離心上述溶液，收集上清勿棄，底部殘留絮狀團即為樣品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗滌絮狀團，洗滌后離心，再重復一次洗滌離心，收集離心后獲得的上清，與之前收集的上清混合。小心倒出試管殘留的液體，將絮狀團置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同時用磁力攪拌機劇烈攪拌。用醋酸鹽緩沖液將這個溶液調至中性，用AMG將淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD）測定，這也是對樣品中RS含量的測定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的測定可通過集中的上清液并定容至100ml，再用GOPOD測定D-葡萄糖完成。
應用性和精確性
這個方法需要樣品中RS含量多于2% w/w，如RS含量多于2% w/w，常規標準誤差為±5%，少于2% w/w RS的誤差更高。
試劑盒組成與配制
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試劑名稱 |
儲存條件 |
SH0635-100T |
注意事項 |
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試劑一 |
-20℃ |
液體5ml×1瓶
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用之前可分為適當大小的等分試樣，并在使用期間儲存在-10℃以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用過程中保持冷卻。（未配制時在-20℃穩定2年以上，配制使用后在-20℃穩定1~3個月） |
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試劑二 |
-20℃ |
粉劑5g×1瓶
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用100ml順丁烯二酸鈉緩沖液(100mM，pH6.0)懸浮1g試劑二中的產品，攪拌5分鐘。加入1.0ml稀釋后試劑一（過程見：溶液/懸浮液的制備），混勻，>1500g離心10分鐘，慢慢倒出上清液，這就是制備的試劑二。（試劑二制備后應當天使用） 注：可根據實驗過程中的使用量適量配制 |
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試劑三 |
4℃ |
粉劑×1瓶 |
加500ml蒸餾水溶解混勻，用pH計調節至pH7.4，最后用蒸餾水定容至500ml，即為試劑三。（pH若高于7.4，用1M磷酸二氫鉀和0.22M對羥苯甲酸的混合液調pH至7.4，pH若低于7.4，用1M磷酸三鉀和0.22M對羥苯甲酸的混合液調pH至7.4） |
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試劑四 |
-20℃ |
粉劑 mg×1瓶
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用20ml試劑三緩沖液溶解試劑四中的內容物，并將其定量轉移到含有剩余試劑三緩沖液的瓶子中。用鋁箔蓋住這個瓶子，以保護密封的試劑不受光照，此試劑為 GOPOD試劑。（未配制時在2-5℃或＜-10℃下存放超過12個月，配制使用后在2-5℃或＜-20℃可穩定1~3個月） 備注：如果該試劑要以冷凍狀態儲存，則最好將其分為200 ml的小份，在使用過程中僅冷凍/解凍一次。 新制備試劑時，其顏色可能為淺黃色或淺粉色。在4°C下，2-3個月后，若該溶液將呈現出更強烈的粉紅色應立即對照蒸餾水讀數，吸光度應小于0.05，若大于此數值，則表示該溶液不可再使用。 |
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標準品 |
4℃ |
液體5ml×1瓶
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D-葡萄糖標準溶液（5 ml，1.0 mg/ml）
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溶液/懸浮液的制備
使用瓶子1中提供的的產品（試劑一），這個溶液是有粘性的，因此應使用移液器移取分裝。（4℃下穩定性> 3年）稀釋后試劑一：取2 ml瓶子1中溶液用100mM pH6.0順丁烯二酸鈉緩沖液稀釋至22ml。（注：以5 ml為單位分裝后用聚乙烯管冷凍保存，反復凍融不會影響穩定性，穩定性-20℃ >5年）
沒有提供的試劑（應購買分析純級）
1.順丁烯二酸鈉（馬來酸鈉）緩沖液(100mM，pH6.0)加上2mM二水氯化鈣和疊氮化鈉（0.02%w/v）：用1600ml蒸餾水溶解23.2g順丁烯二酸，用4M（160g/L）氫氧化鈉調節pH至6.0，加入0.6g二水氯化鈣和0.4g疊氮化鈉，混合并溶解，定容至2L。（4℃下可保存一年）
2.醋酸鈉緩沖液（1.2M，PH3.8）：將69.6ml的冰醋酸（1.05g/ml）加至800 ml的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調節pH至pH3.8，用蒸餾水定容至1L。（室溫下可保存一年）
3.醋酸鈉緩沖液（100mM，PH4.5）：將5.8ml的冰醋酸加至900 ml的蒸餾水中，用4M氫氧化鈉調節pH至4.5，用蒸餾水定容至1L。（4℃保存2個月）
4.氫氧化鉀溶液（2M）：將112.2gKOH加至900 ml的去離子水中，攪拌溶解。定容至1L，密封保存。（室溫下可保存2年）
5.含水乙醇（或者IMS）（大約50%v/v）：將500ml乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工業甲基化酒精（IMS；變性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500ml的水中，密封保存。（室溫下穩定保存>2年）
設備（推薦）
1. 離心式粉碎機，帶有齒輪轉子和1.0mm篩子，或類似的裝置。小型樣品可選擇旋風磨碎機替代
2.絞肉機-手動或電動的，裝有4.5mm篩
3.臺式離心機-能夠放入16×120mm玻璃試管，速度大約1500g(3000rpm)
4.振蕩水浴器，可設定為每分鐘100次直線運動（振蕩速度為每分鐘200里程），振蕩距離35mm,37℃
5.水浴鍋-能夠保持在50+0.1℃
6.渦旋混勻器
7.磁力攪拌器
8.磁力攪拌棒-5×15mm
9.pH計
10.計時器
11.分析天平（精確到0.1毫克）
12.分光光度計-能夠設定510nm（10mm路徑長度）
13.100μL移液器及一次性槍頭
14.連續分配器配有50ml管嘴，能夠移取2.0ml，3.0ml和4.0ml
15.培養管-螺旋帽，16×125mm
16.玻璃試管-16×100mm，14ml容量
17.塑料盒，可放置試管架，也可作為冰盒使用
18.溫度計-能夠讀取37+0.1℃和50+0.1℃
19.容量瓶-100ml，200ml，500ml，1L，2L
樣品制備
用磨碎機研磨大約50g谷物樣品或凍干植物或食品，使樣品粉末可過1.0mm篩，轉移所有的材料至廣口瓶，顛倒振蕩混勻。工業淀粉一般不用研磨，用絞肉機粉碎鮮樣（如罐裝的豆子，香蕉，土豆），過4.5mm篩，測定干樣中的含水量，根據AOAC法925.10，凍干后烘爐干燥測定鮮樣中的含水量。
分析方法
（a）水解和溶液化非抗性淀粉
1.準確稱取100mg（±5 mg）樣品后直接倒入有螺旋帽的試管里，輕柔的拍打試管以保證樣品集中在底部。
注意：對于濕樣，樣品大概為0.5g（準確稱重），這些材料的含水量通常為60-80%。
2.每個試管中加入4.0 ml試劑二。
3.蓋緊試管蓋子，用渦旋振蕩器混勻，臥式放入振蕩水浴器，與運動方向平行。
如下圖所示：
5.把試管從水浴鍋中拿出，用紙巾擦掉多余的水，拿開蓋子，加入4.0ml乙醇（99% v/v）或者IMS（99% v/v），用渦旋器渦旋。
6.1500g離心，10分鐘（不加蓋）。
7.小心倒出上清，加入2ml 50%乙醇或50% IMS重懸浮，用渦旋器渦旋，再加入6ml 50%IMS，混合，1500g離心，10分鐘。
8.小心倒出上清，重復上述重懸浮和離心步驟。
9.小心倒出上清，翻轉試管，用紙巾吸除多余的液體。
（b）測定抗性淀粉含量
1.將試管冰浴，再向每個試管中加入磁力攪拌棒和2 ml 2M的KOH，用磁力攪拌機在冰浴/水浴狀態下攪拌20min，以重懸浮絮狀物和溶解RS。
如下圖所示：
備注：
（1）不要使用渦旋器混勻，那將會導致淀粉乳化。
（2）確保邊加入KOH溶液邊劇烈攪拌試管里的樣品，這將會避免形成難溶的淀粉塊。
2.向每個試管中加入8 ml （1.2M pH3.8）醋酸鈉緩沖液，并用磁力攪拌機攪拌，立即加入0.1ml試劑一,混勻，并放入50℃水浴。
3.孵育30min,期間用渦旋器間歇混勻。
4.對于RS含量>10%的樣品，用水洗瓶定量轉移試管里的樣品至100ml容量瓶，當用洗瓶洗滌試管中的溶液時用外磁鐵保持試管中的磁力棒，用蒸餾水定容至100ml，并混勻，以單位體積離心溶液，1500g，10min。
5.對于RS含量<10%的樣品，直接離心1500g,10min（非稀釋），對于這些的樣品，試管里的最終體積大約為10.3ml。（體積可能會變化，如果分析的是濕樣，在計算數值時應注意折扣）
6.將稀釋的（4）或非稀釋的（5）上清液以0.05ml為單位轉移至玻璃試管（16×100mm），一式兩份，加入1.5mlGOPOD試劑，50℃孵育20分鐘。
7.孵育完成后各取出200ul溶液，分別測量每一個溶液的在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。（備注：反應結束后，放冷5min內測完結果）
制備空白試劑
準備空白試劑：通過混勻0.05ml的100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和1.5ml的GOPOD試劑，孵育完成后各取出200ul溶液進行同上檢測。
制備D-葡糖糖標準品（一式四份）通過混合0.05mlD-葡萄糖（1mg/ml）和1.5ml的GOPOD試劑，孵育完成后各取出200ul溶液進行同上檢測。
（c）計算非抗性（可溶性的）淀粉
1.收集起始孵育[(a)7]過程中離心獲得上清液和兩次50%乙醇洗滌[(a)8和9]獲得的上清液至容量瓶中，用100mM的醋酸鈉緩沖液（pH4.5）定容至100ml，混勻。
2.以0.05 ml為單位孵育溶液（一式兩份）并加入5μL稀釋試劑一, 50℃孵育20分鐘,加入1.5 ml GOPOD試劑，50℃孵育20分鐘，孵育完成后各取出200ul溶液，分別測量每一個溶液的在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。（備注：反應結束后，放冷5min內測完結果）
3.計算在510nm下相對于空白試劑的吸光度值。
4.計算非抗性淀粉的含量。
計算
計算樣品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和總淀粉含量（%，在干重的基礎上），計算模板如下：
抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含>10%RS） = ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
= ΔE×F/W×90
抗性淀粉（g/100g樣品）（樣品包含<10%RS）= ΔE×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180
= ΔE×F/W×9.27
非抗性淀粉含量（g/100g樣品）=ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=ΔE×F/W×90
總淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量
ΔE=相對于空白試劑的吸光度值；
162/180=從測定獲得的游離D-葡萄糖轉換到淀粉中存在的脫水-D-葡萄糖的因子；
F=從吸光度值到微克的轉換（在GOPOD反應中50μgD-葡萄糖的吸光度值是確定的，F=50（D-葡萄糖的μg數）除以這50μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值）；
100/0.1=體積校正（從100ml取0.1ml）； 1/1000=從ug到mg的轉換；
W=分析樣本的干重 =重量×（100-含水量）/100； 100/ W=RS在樣品重量中百分比因子；
10.3/0.1=體積校正（從10.3 ml取0.1ml），對于含有0-10%RS，當孵育溶液時沒有被稀釋。