enLbCas12a Nuclease
| 貨號 | 32135 | 售價（元） | 詢價 |
| 規格 | 100pmoL/1000pmoL | CAS號 |
- 產品簡介
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產品簡介
enLbCas12a（enhanced LbCas12a）是一種基于野生型LbCas12a核酸內切酶升級改造獲得的高活力LbCas12a突變體。與野生型LbCas12a的作用機制一樣，enLbCas12a也通過crRNA介導，靶向識別帶有PAM序列（5’-TTN-3’）的雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并產生粘性末端。同時，enLbCas12a對單鏈DNA靶標的識別和剪切不依賴PAM序列。雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活enLbCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當enLbCas12a酶與crRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異ssDNA序列的反式剪切活性，將體系中的ssDNA序列切碎。因此，enLbCas12a酶不僅可用于體外dsDNA的特異剪切，也可用于靶標核酸的快速檢測。
產品組分
| 組分 | 32135-01 (100 pmol) | 32135-03 (1,000 pmol) |
 enLbCas12a Nuclease (10 μM) a |
100 pmol | 1,000 pmol |
 10×HOLMES Buffer for Cas12a |
1 mL | 1 mL |
a. enLbCas12a Nuclease濃度為10 μM，即10 pmol/μL；100 pmol規格的總體積為10 μL，1,000 pmol規格的總體積為100 μL；
保存條件
-80℃或-20℃儲存；干冰運輸。
活性定義
在總體積為20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反應體系中，37℃反應條件下，1 min內剪切1 pmol ssDNA探針所需的Cas12a酶量定義為1 transU。
例：若某批次enLbCas12a酶的反式切割活性為80.0 transU/pmol，則表明1 pmol的該批次enLbCas12a酶可在1 min內，在上述指定的反應條件下，反式切割80 pmol ssDNA探針。
實驗流程
1. 順式剪切實驗
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
| 10×HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM enLbCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
| 1 μM Target DNA b | 0.5 μL | 25 nM |
| Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
b. 順式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。
若用核酸電泳來分析順式剪切產物，建議使用dsDNA靶標，因為ssDNA靶標會被反式激活的Cas12a進一步切碎。對于20 μL順式剪切應體系，推薦target DNA的使用量為100 ng～500 ng，且target DNA片段長度在300 bp～3 kb范圍內。不同長度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根據target DNA的摩爾量計算，建議保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩爾比為10:10:1，以盡量確保target DNA被剪切完全。
37℃反應30 min ~ 1 h，85℃滅活5 min，核酸電泳分析順式剪切產物。
2. 反式剪切實驗
| 組分 | 體積 | 終濃度 |
| 10×HOLMES Buffer for Cas12a | 2 μL | 1 × |
| 10 μM enLbCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| 1 μM Target DNA c | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
| 10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
| Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
c. 反式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。
反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實驗目的進行調整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，enLbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的Cas12酶長期保存，請使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀釋，但極低濃度的Target DNA（例如LOD實驗）建議用0.1% Tween 20稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
實時熒光定量PCR儀檢測熒光信號，37℃反應，每30 sec采集一次熒光信號。
實驗結果
注意事項
1. 高活力的enLbCas12a酶crRNA的DR序列（Direct Repeat）與野生型LbCas12a（#32108）一致，可以在反應體系中用enLbCas12a酶直接替換野生型LbCas12a。
2. 不同來源的Cas12a酶，其識別靶標所需的PAM位點也略有不同，其中大部分Cas12a酶可識別TTN或TTTN位點。
3. Cas12a的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a在crRNA的引導下，特異性地剪切target DNA。dsDNA靶標需帶有PAM位點，而ssDNA靶標不依賴PAM位點。
4. Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)：當target DNA存在時，Cas12a/crRNA與target DNA形成三元復合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時，Cas12a被激發反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈DNA切碎。
5. 利用本產品的反式剪切活性進行分子診斷實驗，可參考本公司的HOLMES體系[1]。
6. 為防止RNase污染，請保持實驗區干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為RNase-free。
7. Cas12a酶對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
8. 本產品僅供科研使用。